Diana nasceu em Saint-Vallier, filha de Jean de Poitiers, Senhor de Saint Vallier, e de Joana de Batarnay. Ainda na juventude fez parte do séquito de Anne de Beaujeu, filha do rei Luís XI. Embora tivesse um irmão e duas irmãs, foi Diana quem conquistou o coração de seu pai, e era ela quem ele levava para caçar e cavalgar nas primeiras horas da manhã. Durante toda a vida ela seguiria seu treinamento de disciplina do corpo, levantando-se ao amanhecer para banhar-se na água fria da fonte. Aos seis anos de idade ela tinha seu próprio falcão e, bem-disposta e com boa saúde, em poucos anos era capaz de controlar qualquer cavalo do estábulo de seu pai. À semelhança de outras damas de sua época, ela usava uma máscara de veludo preto quando cavalgava, para preservar a cútis e proteger-se dos galhos enquanto caçava.
Como sua mãe morreu jovem, deixando-a órfã e sob a tutela do pai, a educação de Diana foi cuidadosamente orientada pela família de seu pai. Aos seis anos, foi enviada para a casa de uma princesa da França, Anne de Beauje, duquesa de Bourbon, filha de Luís XI e irmã de Carlos VII. Era costume na França que as meninas de alta linhagem fossem criadas na casa de uma dama importante e culta.
Anne de Beauje, descrita por um de seus alunos como "alta e grave como uma catedral", os encorajava a usar sua célebre biblioteca, que continha não só obras famosas da literatura clássica como manuscritos religiosos lindamente encadernados. Diana nunca se esqueceria desta biblioteca, e, anos mais tarde, modelou a sua pela que conhecera e amara em Moulins. Diana também aprendeu com sua sábia e bem-nascida parenta o verdadeiro significado da dignidade de sua posição, a ter um comportamento íntegro, honesto, a ter gostos e posturas nobres e, acima de tudo, a desprezar as intrigas e a malidicência.
Segundo Brantôme, historiador da época, não havia nenhuma dama de família de alta linhagem no país que não tivesse em algum momento sido ensinada por esta extraordinária filha real da França. Anne de Beauje rapidamente reconheceu os talentos de Diane de Poitiers, e percebeu que o potencial desta era bem superior ao do das outras meninas que educava, mesmo ao da sua própria filha Suzanne, para quem ela havia escrito seu famoso guia educativo "Les Enseignements d´Anne de France à sa fille Suzanne de Bourbon". Trata-se de um documento extraordinário que expõe os mais elevados ideais e princípios morais, muitos dos quais Anne aprendera com seu pai, o rei Luís XI. Sua recomendação final era a seguinte: En toute chose on doit tenir le moyen - "Mantenha sempre uma visão equilibrada de todas as coisas" -, uma máxima que Diana de Poitiers jamais se esquecera.
A vida toda de Diana foi marcada por uma conduta modelada por tais ensinamentos. Era uma mulher admirável, honesta, empreendedora, independente, uma verdadeira lady. Por isso, ela sempre foi respeitada na corte, mesmo, tendo se tornado, mais tarde, a amante de Henrique II.
